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●全民抗"疫" 終獲勝利 ●

在中國疫情防控工作取得了明顯成效的時候，境外疫情暴發(fā)增長態(tài)勢卻仍在持續(xù)，導(dǎo)致我國外防輸入壓力增大，國內(nèi)防止疫情反彈的復(fù)雜性也在增加。為貫徹落實常態(tài)化疫情防控工作中“外防輸入、內(nèi)防反彈”的工作要求，進一步強化醫(yī)療機構(gòu)感染防控的各項措施，最大限度降低院內(nèi)感染，鞏固來之不易的防控成果，國務(wù)院于5月1日發(fā)布了《關(guān)于落實常態(tài)化疫情防控要求進一步加強醫(yī)療機構(gòu)感染防控工作的通知》，強調(diào)：

1.充分認識院內(nèi)感染防控面臨的嚴峻形勢

2.嚴格落實發(fā)熱門診管理要求

3.加強患者收入院管理

4.強化新冠病毒核酸檢測

5.嚴格落實標準預(yù)防

6.開展院內(nèi)感染風(fēng)險排查整頓

其中關(guān)于核酸檢測能力方面強調(diào)“各地應(yīng)當(dāng)加強醫(yī)療機構(gòu)實驗室建設(shè)，對所有三級醫(yī)院以及縣醫(yī)院開展建設(shè)，使其迅速達到新冠病毒核酸檢測條件；對其他二級以上醫(yī)院也應(yīng)當(dāng)同時加強建設(shè)，使其逐步達到新冠病毒核酸檢測條件，根據(jù)疫情防控形勢需要隨時能夠開展核酸檢測工作。”

一般三級醫(yī)院都擁有標準PCR實驗室與具備核酸檢測的能力。而此次對二級醫(yī)院也提出同樣要求，意味著二級醫(yī)院也需要配備PCR實驗室。本文分上下兩部分來聊一聊PCR實驗室設(shè)計、裝修，相關(guān)儀器設(shè)備，人員配置及管理等，供大家交流學(xué)習(xí)。

01

場地要求及實驗室設(shè)計

場地要求參照以下文件：

《醫(yī)療機構(gòu)管理條例》

《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》

《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》

《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》

標準的PCR實驗室一般分為四個區(qū)，一區(qū)為試劑準備區(qū)，二區(qū)為標本制備區(qū)，三區(qū)為PCR擴增區(qū)，四區(qū)為產(chǎn)物分析區(qū)。

為避免交叉污染，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)。各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進行。如今市面上絕大部分新冠病毒檢測試劑盒是在熒光定量PCR平臺上開發(fā)的，因此沒有產(chǎn)物分析區(qū)也不會影響新冠病毒的檢測，60-80平米的場地就能滿足要求，但是其他如基于一代測序與基因芯片的檢測項目就無法開展。大致設(shè)計如下圖：

整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊，每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。

在實驗區(qū)和緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準備區(qū)和標本制備區(qū)還設(shè)置移動紫外線燈，對實驗桌進行局部消毒。

試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。

地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好，便于進行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚，瓷磚間接縫需要小于2mm。

試劑準備區(qū)

該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。

試劑和用于標本制作的材料應(yīng)直接運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。

試劑準備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-80°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內(nèi)。

房間的面積宜控制在15㎡~20㎡。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對正壓狀態(tài)，以防止外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染。

標本制備區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。

標本制備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-20°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內(nèi)。在標本制備區(qū)，還需要配備生物安全柜，用于進行提取核酸的操作。

為避免提取的核酸在柜內(nèi)反復(fù)循環(huán)，造成標本之間的交叉污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，該區(qū)域配備的生物安全柜必須是B2型的。生物安全柜工作區(qū)垂直氣流全部來自實驗室，排風(fēng)經(jīng)過高效過濾器過濾后直接排至室外，不允許回到安全柜和實驗室中。

根據(jù)經(jīng)驗，如果實驗室內(nèi)配備生物安全柜，每配備一臺，實驗室的面積增加10㎡；標本制備區(qū)的面積宜在25㎡~30㎡之間。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。

擴增區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。

在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。

擴增室主要配備PCR實驗室的核心儀器PCR儀，在實驗室建造過程中，需要給PCR儀配備專門的UPS電源，以保證其正常工作。該區(qū)面積控制在15㎡~20㎡。

本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進行。建議采用≥10Pa壓差，在控制上比較容易實現(xiàn)。

產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。

在室內(nèi)配備通風(fēng)櫥，保證房間內(nèi)的相對負壓，空氣從室外流向室內(nèi)。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。

本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。建議采用≥10Pa壓差，在控制上比較容易實現(xiàn)。

02

PCR實驗室污染的預(yù)防與控制

PCR實驗室設(shè)計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實驗結(jié)果必須作廢，需重新進行實驗。所以發(fā)生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。

工作區(qū)域的嚴格劃分

（1）各個實驗區(qū)域設(shè)置合理；

（2）各個實驗區(qū)域要有明顯的標記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實驗區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。

合理的系統(tǒng)設(shè)置

（1）合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；

（2）嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。

規(guī)范的操作

（1）臨床基因擴增檢驗實驗室的技術(shù)人員必須進行上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作；

（2）在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施；

（3）清潔工作及時、正確。實驗工作結(jié)束后，必須立即對本區(qū)進行清潔。除常規(guī)的消毒液體對表面進行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對一些實驗設(shè)備還應(yīng)進行高壓消毒處理。

嚴格的管理

（1）嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關(guān)的人員不得隨意進出實驗室，有條件的情況下要設(shè)置獨立的通道和進出整個實驗區(qū)的門；

（2）在各個實驗區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標志的工作服（如不同顏色），當(dāng)工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；

（3）盡量減少在實驗區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性。

（4）擴增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；

（5）擴增產(chǎn)物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實驗人員的安全防護。

03

完備的實驗室配套設(shè)施

完備的實驗室配套設(shè)施是保證實驗工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個實驗室實驗內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺、離心機、加樣器等。

PCR實驗室主要設(shè)備見下表

本表所列儀器為滿足新冠病毒檢測所需的最低配置，空調(diào)排風(fēng)系統(tǒng)等不算在內(nèi)。

04

PCR實驗室質(zhì)量控制

為實現(xiàn)高質(zhì)量的檢測結(jié)果，采取嚴格的實驗室管理體系極為重要。

根據(jù)實驗室的具體情況制定和編寫質(zhì)量體系文件，《質(zhì)量手冊》、《程序文件》、《作業(yè)指導(dǎo)書》，并嚴格執(zhí)行。

管理體系的特點是應(yīng)有明確的目的、規(guī)范的管理、有效的制約、高效并自我調(diào)節(jié)的機制，具體要求如下：

1、建立完善的SOP文件，對完成各項質(zhì)量活動的方法作出規(guī)定，每個SOP都應(yīng)對一個或一組相互關(guān)系的活動進行描述。

2、每個SOP文件應(yīng)說明該項質(zhì)量各環(huán)節(jié)的輸入、轉(zhuǎn)換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關(guān)活動的接口關(guān)系。

3、明確每個環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)換過程中各項因素的要求，即由誰做、做什么、做到什么程序、達到什么要求，如何控制、形成什么記錄和報告，以及相應(yīng)的審批手續(xù)。

4、規(guī)定在質(zhì)量活動中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施。SOP應(yīng)簡練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴格遵守。

5、盡量減少在實驗區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性。擴增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，廢液必須經(jīng)消毒液浸泡后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡后統(tǒng)一處理。

6、用到某些有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實驗人員的安全防護。完備的實驗室配套設(shè)施是保證實驗工作的必要條件。

05

人員配置

為保障實驗室的正常運行需要1名副高職稱以上的檢驗技術(shù)人員，2名中級職稱以上的檢驗技術(shù)人員，目前對新冠病毒檢測能力需求迫切，但是一個高質(zhì)量PCR實驗室的建設(shè)也不是在朝夕之間能完成。

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