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新型冠狀病毒肺炎

新型冠狀病毒肺炎又稱“2019-nCoV“，是2019年在人體中發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒新毒株，起源于武漢。該病毒癥狀一般為發(fā)熱、乏力、干咳、逐漸出現(xiàn)呼吸困難。你知道新冠病毒是如何檢測的嗎？

新冠病毒的檢測

01、認識冠狀病毒

冠狀病毒是一個大型病毒家族,因該病毒形態(tài)在電鏡下觀察類似王冠而得名。目前為止發(fā)現(xiàn)，冠狀病毒僅感染脊椎動物，可引起人和動物呼吸道、消化道和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如感冒以及中東呼吸綜合征(MERS)和嚴重急性呼吸綜合征(SARS)等較嚴重疾病。

眾所周知，新型冠狀病毒潛伏期為14天，當出現(xiàn)呼吸困難、乏力、高燒等現(xiàn)象，應(yīng)當盡早報備相關(guān)機構(gòu)，盡早提取標本進行檢驗篩查。相信大家都很好奇,新冠病毒是如何被檢測出來的呢?

02、新冠病毒核酸檢測流程

采取咽拭子樣本，送到檢驗醫(yī)學中心,實驗室內(nèi)會為核酸檢測準備4個區(qū)域，分別是試劑準備區(qū)、樣本準備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。

其中試劑準備區(qū)負責接收患者樣本，樣本準備區(qū)則負責進行對樣本的核酸進行提取，擴增區(qū)則是擴增復制核酸樣本，擴增后分析區(qū)就是分析樣本內(nèi)核酸能能否與標準樣配對，通過儀器檢測的到，就判斷成陽性，如果檢測不到就是陰性。

03、認識PCR實驗室

PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))實驗室又叫基因擴增實驗室，是一種分子生物學技術(shù),用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng),能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測新型冠狀病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據(jù)。

PCR實驗室分類：普通PCR實驗室、全自動定量PCR實驗室、一體自動化分析PCR實驗室。

04、PCR實驗室的四個分區(qū)

01、試劑準備區(qū)

功能作用：試劑準備區(qū)是PCR實驗室中最為“潔凈”的區(qū)域，它不應(yīng)有任何核酸成分的存在，否則將嚴重影響檢測結(jié)果的準確性。標本的制備應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進行。

主要設(shè)備：冰箱、低溫冰箱、混勻器、微量加樣器(0.2-1000ul)、移動紫外燈。

試劑制備

02、樣本準備區(qū)

功能作用：核酸提取、貯存，擴增反應(yīng)管制作。

主要設(shè)備：冰箱、超低溫冰箱、高速冷凍離心機、混勻器、微量加樣器(0.2-1000ul)、移動紫外燈、水浴鍋、生物安全柜。

03、擴增區(qū)

功能作用：擴增反應(yīng)體系的配置和核酸的提取加入要在擴增區(qū)內(nèi)進行。

主要設(shè)備：擴增儀、離心機、微量加樣器(0.2-1000ul)、移動紫外燈。

生物安全柜內(nèi)操作

04、擴增產(chǎn)物分析區(qū)

功能作用：產(chǎn)物分析區(qū)最后一個工作區(qū)域，用于擴增片段的分析，由于本工作區(qū)域應(yīng)設(shè)置為負壓狀態(tài),空氣流向為由外向內(nèi)，以防止擴增產(chǎn)物的氣溶膠的流出(一般四個分區(qū)皆設(shè)置緩沖間)。

主要設(shè)備：凝膠成像分析儀、電泳儀、電泳槽、微量加樣器(0.2-1000ul)、移動紫外燈。

即：試劑準備區(qū)→樣本準備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)。

PCR 實驗室的各個實驗區(qū)域之間應(yīng)形成單向工藝流、物流、人流與氣流，實現(xiàn)單向流程的屏障保護。通過嚴格的單向流線，避免實驗之間的相互干擾和交叉污染，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染，產(chǎn)生假性結(jié)果。

避免交叉感染

PCR實驗室的氣流壓差原理及控制：

1、試劑準備區(qū)是工藝流線的開始，設(shè)計為正壓或常壓,避免外界環(huán)境的污染。

2、樣品準備區(qū)一般為常壓或負壓，大多數(shù)情況下設(shè)計成二級生物安全實驗室,避免實驗產(chǎn)物溢出,污染外界環(huán)境。

3、擴增區(qū)為負壓，避免實驗產(chǎn)物溢出，污染外界環(huán)境。

4、擴增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，通常壓力設(shè)計為最低，避免實驗產(chǎn)物溢出，污染外界環(huán)境。

供參考

05、PCR實驗室的設(shè)計

PCR實驗室的送排風設(shè)計及排放準則:

1、氣流組織宜采用上送下排;

2、生物安全柜上方不得設(shè)計送風口;

3、高效過濾排風口應(yīng)設(shè)計在實驗室內(nèi)污染最嚴重的區(qū)域，且為單向;

4、不得循環(huán)送排風。

PCR實驗室排風應(yīng)有效處理達標后在2m以上高空進行排放。

怎么定義為陽性?

20世紀70年代以來，國際上統(tǒng)一了冠狀病毒的命名，了解了病毒的基因結(jié)構(gòu)和部分功能，研究出好幾種可識別病毒生長的指標，只有定下指標,才能檢測你是陽性陰性。

那么“新冠病毒”是怎么被定義為陽性的?

“新冠病毒陽性”要確認這一點，必須從樣本(比如痰、汗液、血液、糞便等等)里提取出完整的病毒。在這次疫情暴發(fā)之初,我們有聽到一些新聞所謂“分離出病毒株”，大概指的就是這個。

這個操作挺麻煩的，并且不是每一次都能分離成功。只能作為“確實有病毒在這里”的絕對證據(jù)。但作為給患者的檢測，既慢，又不夠準確。因此，現(xiàn)在我們聽到更多的，是“新冠病毒核酸檢測陽性”。

所謂“新冠病毒核酸檢測陽性”，又是怎么來的呢? 首先,提取樣本。就是把痰啊、咽拭子采到的東西啊、糞便啊等等，先想辦法收起來，拿到實驗室把樣本里面的核酸(就新冠病毒而言，指RNA)提取出來。RNA提取之后，降解速度非?？?。因此，其實我們需要把RNA再對應(yīng)的轉(zhuǎn)成為cDNA。

接下來的過程，本質(zhì)叫做PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))。大致意思就是用特別的標簽，把新冠病毒最特征的那一段信息(原本是RNA信息,此時已經(jīng)對應(yīng)轉(zhuǎn)換成為cDNA信息)給識別出來。不只是識別，這個過程是在識別的基礎(chǔ)上，反復的復制這一段。那么經(jīng)過一段時間，原來在樣本里只有一點點的信息，就被擴增到很多了，也就容易查到了。

檢測用到的，叫做realtimePCR。啥意思呢？就是說病毒的核酸信息每一次被復制都會被記錄下來。這樣檢測更準確。并且,理論上說,甚至可以推斷出樣本里面的病毒核酸的密度。

如果樣本里面沒有病毒核酸,那么那個尋找病毒信息的標簽,就永遠也找不到落點。這時候當然不可能有任何東西被復制出來,那么檢測結(jié)果就是陰性。

如果樣本里面有病毒核酸,那么標簽就可以找到它,并且復制它,然后發(fā)出信號告訴檢測者:這里有病毒。這,就是核酸檢測陽性。

然而,當樣本里的病毒核酸數(shù)量特別少的時候,標簽可能找不到……這就會造成檢測的假陰性。

如果標簽的靈敏度不夠，也會出現(xiàn)找不到病毒核酸的情況。這也會造成檢測的假陰性。 某些患者檢測若干次都是陰性，最后才發(fā)現(xiàn)是陽性,

簡單來說，就是有可能是取樣的時候沒有取到病毒最多的地方，或者當時患者體內(nèi)的病毒確實不多，或者檢測的試劑靈敏度不夠。

當然，還有其他諸如環(huán)境因素、儀器問題等等的原因。要知道,任何檢測手段都是有局限的，偶爾的例外并不是稀罕事。另外，因為目前對于新冠的了解不到位，檢測不能一步到位，這也確實是現(xiàn)實。

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